Assassin's Creed II - це екшн-гра у відкритому світі, дуже схожа за концепцією та механікою ігрового процесу на попередника. Події гри відбуваються у Флоренції, Венеції, Римі та інших місцях Італії. Окрім вигаданих персонажів, у грі є відомі історичні особи того періоду, такі як Леонардо да Вінчі, Нікколо Макіавеллі, Чезаре Борджія та інші, які відіграють активну роль в історії гри. У грі представлено справжнє культурне та політичне середовище італійського Відродження разом із вигаданими розповідями про події, альтернативною історією та метафізичними теоріями.
Основний ігровий процес нагадує попередній. Головний герой може вільно досліджувати кілька великих міст та сільських районів пішки або на конях. У грі також можна плавати та орієнтуватися на човнах. Майже на кожну будівлю можна піднятися, і головний герой може отримати доступ до найвищих дахів, спостерігаючи за панорамою за допомогою свого Орлиного бачення. Стрибки та біг у вільній формі займають значну частину ігрового процесу.