Действие игры Resident Evil: Zero происходит до событий оригинальной Resident Evil. Вы берете на себя роль одного из двух персонажей: Ребекки Чемберс, медика из команды "Браво", с которой вы познакомились в первой игре, и Билли Коэна, бывшего заключенного, которого перевозят в тюрьму. Игра начинается с полета вертолета команды "Браво", направляющегося на расследование серии убийств. Что-то случается, и вертолет терпит крушение. Всем удается выжить, но когда все начинают поиски, они натыкаются на перевернутый военно-транспортный грузовик, внутри которого нет ничего, кроме трупов. Ребекка Чемберс, самый молодой член команды S.T.A.R.S. Alpha Team, отправляется исследовать роскошный поезд компании "Амбрелла", который загадочным образом заглох посреди леса. Теперь вы берете под свой контроль Ребекку, и ваше путешествие начинается.
В дополнение к традиционному для серии геймплею ужастика на выживание, игра вводит систему "напарника", которая позволяет вам в любой момент переключаться между Ребеккой и Билли. Эту функцию иногда приходится использовать, поскольку игра требует, чтобы оба персонажа работали вместе для решения некоторых головоломок. В игре появилось множество страшных врагов, таких как сороконожка-мутант, новые области для исследования и возможность бросать предметы на землю вместо того, чтобы искать ящик с предметами.
В отличие от оригинальной версии игры для GameCube, все последующие улучшенные версии включают дополнительный режим Вескера, который открывается после прохождения игры. Этот режим добавляет два новых костюма: костюм Ребекки с красными глазами и костюм Вескера для Билли с определенными специальными способностями Вескера. Оба костюма, похоже, были созданы на основе костюмов Вескера и Джилл из игры Resident Evil 5, которая вышла после релиза этой игры на GameCube.