У 2012 році, здавалося б, звичайного бармена на ім'я Дезмонд Майлз викрадає таємнича організація. Викрадачі приєднують Дезмонда до дивного пристрою під назвою "Анімус", який дозволяє йому отримати доступ до пам'яті його предка, найманого вбивці на ім'я Алтайр. З якихось причин реконструкція спогадів Алтайра життєво необхідна викрадачам.
Отримавши доступ до пам'яті Алтайра, Дезмонд отримує можливість пережити події, що відбувалися на Святій Землі в 1191 році, під час Третього хрестового походу. Аль Муалім, ватажок асасинів, наказує Алтаїру вбити дев'ять видатних історичних особистостей, які нібито допустили війну і корупцію на Святу Землю.
Протягом більшої частини гри гравець керує Алтаїром, однак чітко вказано, що управління ним є частиною досвіду Десмонда. Гравець також може контролювати Дезмонда між його сеансами в "Анімусі".
Найбільш інноваційною особливістю гри є свобода вибору та пересування. Кожна архітектурна деталь, така як віконні карнизи, різьблення на камені або дерев'яні бруски, може бути використана для пересування по стінах. Це дозволяє гравцеві влаштовувати напружені сцени погоні, якщо за вами випадково полює охорона.
У грі є кілька способів досягти своєї мети. Використовуючи підслуховування, допит і кишенькові крадіжки, ви можете дізнатися інформацію про свою наступну ціль. Потім ви можете використовувати цю інформацію, щоб вибрати, чи будете ви брати на себе цілі шляхом повної лобової атаки або за допомогою правильно розміщеного метального ножа з прикриття дахів.
Залежно від вашого вибору, вам доведеться мати справу з городянами і лицарями міст, які будуть підозріло ставитися до людини в плащі, що вештається на дахах або поблизу цілей місії. Є кілька ситуацій, коли ви можете змішатися з натовпом, якщо пощастить, ви зможете знищити свою мету, не дивлячись ні на кого, хто дивиться в вашу сторону. У Алтайра є невеликий, але ефективний арсенал зброї, такий як мечі і метальні ножі, і він може вивчати нові бойові навички, які допоможуть йому в його місії.