В 2012 году обычный на первый взгляд бармен Дезмонд Майлз похищен таинственной организацией. Похитители подключают Дезмонда к странному устройству под названием "Анимус", которое позволяет ему получить доступ к памяти своего предка, убийцы по имени Альтаир. По какой-то причине восстановление воспоминаний Альтаира жизненно важно для похитителей.
Получив доступ к памяти Альтаира, Дезмонд может пережить события, происходившие в Святой земле в 1191 году, во времена Третьего крестового похода. Аль Муалим, лидер убийц, приказывает Альтаиру убить девять выдающихся исторических личностей, которые якобы позволили войне и коррупции захватить Святую землю.
На протяжении большей части игры игрок управляет Альтаиром; однако ясно указано, что управление им является частью опыта Дезмонда. Игрок также может управлять Дезмондом между его сеансами в "Анимусе".
Самой инновационной особенностью игры является свобода выбора и передвижения. Каждая архитектурная деталь, такая как оконные выступы, резьба по камню или деревянные брусья, может быть использована для перемещения по стенам. Это позволяет игроку устраивать напряженные сцены погони, если вас случайно преследует стража.
В игре есть несколько способов достижения цели. Используя подслушивание, допрос и карманные кражи, вы можете узнать информацию о вашей следующей цели. Затем вы можете использовать эту информацию, чтобы выбрать, как напасть на цель - в лоб или с помощью правильно подобранного метательного ножа из укрытия на крыше.
В зависимости от вашего выбора, вам придется иметь дело с жителями и рыцарями городов, которые с подозрением отнесутся к человеку в плаще, разгуливающему по крышам или вблизи целей миссии. Есть несколько ситуаций, когда вы можете смешаться с толпой и, если повезет, уничтожить цель так, чтобы никто не обратил на вас внимания. У Альтаира есть небольшой, но эффективный арсенал оружия, такого как мечи и метательные ножи, и он может изучать новые боевые навыки, которые помогут ему в выполнении задания.