Марио отправляется в небо и за его пределы, чтобы спасти принцессу. Когда Грибное королевство готовится отпраздновать прибытие кометы, которая появляется в небе каждые сто лет, принцесса Пич посылает Марио приглашение на праздник. Когда Марио прибывает, Боузер и его приспешники нападают на королевство и снова похищают принцессу... и весь ее замок. Марио пускается в погоню, но теряется, когда корабль покидает атмосферу и оказывается на космической станции, построенной на комете, за которой наблюдает таинственная Розалина. Марио предстоит исследовать новые галактики, найти неуловимые Звезды Силы и вернуть своих друзей домой.
Игра Super Mario Galaxy похожа на Super Mario 64: Марио исследует свой новый 3D-мир, бросая вызов гравитации, пересекая различные местности и даже бегая вверх тормашками по поверхности планет. Перепрыгивая с планеты на планету, Марио должен собирать звезды и монеты, используя свои обычные прыжки и вращения (теперь управление осуществляется с помощью пульта Wii Remote). Пульт Wii Remote также используется для сбора недоступных звезд, а также может управляться вторым игроком.
Кроме того, Марио может найти новые костюмы (как в Super Mario Bros. 3), которые позволяют ему превращаться в призрачного Бу Марио, высоко летающего Би Марио, запускать огненные шары как Огненный Марио и кататься по замерзшим озерам как Ледяной Марио. В стремлении получить все 120 звезд Марио ждут новые испытания, включая лучевой серфинг, балансирование на скоростном шаре, плавание в пузырях и другие задачи. Даже Луиджи принимает участие в поисках, внося свой ценный вклад в приключение.