Маріо вирушає в небо і за його межі, щоб урятувати принцесу. Коли Грибне королівство готується відсвяткувати прибуття комети, котра з'являється в небі кожні сто років, принцеса Піч посилає Маріо запрошення на свято. Коли Маріо прибуває, Боузер та його поплічники нападають на королівство і знову викрадають принцесу... і весь її замок. Маріо пускається в погоню, але губиться, коли корабель залишає атмосферу і опиняється на космічній станції, побудованій на кометі, за якою спостерігає таємнича Розаліна. Маріо має дослідити нові галактики, знайти невловимі Зірки Сили та повернути своїх друзів додому.
Гра Super Mario Galaxy схожа на Super Mario 64: Маріо досліджує свій новий 3D-світ, кидаючи виклик гравітації, перетинаючи різні місцевості і навіть бігаючи догори дригом по поверхні планет. Перестрибуючи з планети на планету, Маріо повинен збирати зірки та монети, використовуючи свої звичайні стрибки та обертання (тепер керування здійснюється за допомогою пульта Wii Remote). Пульт Wii Remote також використовується для збору недоступних зірок і може керуватися другим гравцем.
Крім того, Маріо може знайти нові костюми (як у Super Mario Bros. 3), які дозволяють йому перетворюватися на примарного Бу Маріо, що високо літає Бі Маріо, запускати вогняні кулі як Вогненний Маріо і кататися по замерзлих озерах як Крижаний Маріо. У прагненні отримати всі 120 зірок Маріо чекають на нові випробування, включаючи променевий серфінг, балансування на швидкісній кулі, плавання в бульбашках та інші завдання. Навіть Луїджі бере участь у пошуках, вносячи свій цінний внесок у пригоду.